Actividad: Terapia epigenética en Cáncer de Mama

Los tratamientos epigenéticos se han enfocado en  la metilación del ADN, modificación de histonas y expresión anormal de ARN no codificantes, sin embargo se debe entender  la complejidad del tumor para desarrollarlos. Los primeros fármacos aprobados por la FDA son la azacitidina que es un inhibidor del ADN metiltransferasa, ha mostrado modulación positiva de la señalización del interferón, el procesamiento y la presentación de antígenos y las citocinas/ quimiocinas, otro fármaco es el entinostat  a base de benzamida, inhibe las HDAC-1 y HDAC-3, dando como resultado la inhibición del crecimiento de las células tumorales de varios tipos de cáncer.  (1)

Referencias Bibliográficas:

1. Hernández Rodríguez M, Mera Jiménez E, Rodríguez-Fonseca RA, Macías Pérez ME. Oportunidades de la epigenética como enfoque para el tratamiento del cáncer de mama. Revista Mexicana de Mastología [Internet]. 2020;10(3):93–7. Available from: https://www.medigraphic.com/pdfs/revmexmastol/ma-2020/ma203d.pdf

Técnica de edición de ácidos nucleicos: Células T modificadas con CRISPR en pacientes con cáncer refractario

 Tipo: Edición ex vivo de células somáticas T autólogas NY-ESO-1 TCR

Dirigido hacia: Dos genes que codifican las cadenas del receptor endógeno de células T (TCR), TCRα(TRAC) y TCRβ(TRBC) se eliminaron en las células T para reducir el emparejamiento incorrecto de TCR y para mejorar la expresión de un transgén de TCR sintético específico para el cáncer (NY-ESO-1). Eliminación de un tercer gen que codifica PD-1 (PDCD1), se realizó para mejorar la inmunidad antitumoral.

Dirigido por: CRISPR/Cas9

Órgano o célula a tratar: Células T humanas

Vía de administración: Parenteral

Resultados: La transferencia adoptiva de células T modificadas genéticamente a pacientes dio como resultado un injerto duradero con ediciones en los tres loci genómicos. Aunque se detectaron translocaciones cromosómicas, la frecuencia disminuyó con el tiempo. Modificado Las células T persistieron hasta 9 meses, lo que sugiere que la inmunogenicidad es mínima en estas condiciones y demuestra la viabilidad de la edición de genes CRISPR para la inmunoterapia contra el cáncer.

Referencias Bibliográficas:

1. Stadtmauer, EA, Fraietta, JA, Davis, MM, Cohen, AD, Weber, KL, Lancaster, E., … junio, CH (2020). Células T modificadas con CRISPR en pacientes con cáncer refractario. Ciencia, 367(6481), eaba7365. doi:10.1126/ciencia.aba7365. Disponible en: https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.aba7365

Ejemplo de terapia con Stem Cells: Medicina regenerativa para úlceras crónicas en pctes con diabetes mellitus

  Las úlceras crónicas son alteraciones en la piel que toman más de seis semanas en cicatrizar, que afectan a una gran parte de la población con diabetes mellitus.

Tipo de célula: Células troncales mesenquimales derivadas de gelatina de Wharton

Método de obtención: Una vez seleccionadas las posibles donadoras y previa firma del consentimiento informado, se realizó la recolección de los cordones en condiciones de esterilidad, en una solución amortiguada de fosfatos o PBS y se mantuvieron a 4 °C hasta la extracción de las CTM-GW.

Vía de administración: 1) Cuantificación del área de la herida. Para calcular el área de daño se obtuvieron imágenes con una cámara digital Samsung-ST150F. 2) Preparación de la herida. Se realizó la curación con jabón quirúrgico neutro Antibenzil . 3) Preparación de las células para su aplicación: Las CTM-GW fueron despegadas con tripsina/EDTA y se aplicaron 100,000 ± 10,000 células 4) Colocación del Surgicel^® (Ethicon, USA): en el caso 2 se colocó una malla de celulosa regenerada oxidada absorbible 35 x 5 cm² a la herida mediante puntos quirúrgicos con sutura Catgut crómico 3/0 5) Aplicación de las CTM-GW. Se realizó directo en la herida mediante infiltración intradérmica e irrigación en el lecho de la herida en dos ocasiones

Resultados:  Los resultados mostraron que las CTM-GW indujeron la reconstrucción cutánea mediante formación de tejido de granulación, además de disminuir el proceso inflamatorio crónico en la zona de daño, lo que favoreció el índice de cierre de la herida.

Por los resultados obtenidos se propone la utilización de CTM-GW en úlceras flebostáticas crónicas como tratamiento en la regeneración de la estructura tisular con resultados a corto plazo.

Referencias bibliográficas:

1. PARRA-BARRERA, A. et al. Medicina Regenerativa para Úlceras Crónicas: Aplicación Cutánea de Células Troncales Mesenquimales de Gelatina de Wharton. Rev. mex. ing. bioméd [online]. 2019, vol.40, n.2 [citado  2023-02-06], e201832. Disponible en: <http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0188-95322019000200101&lng=es&nrm=iso>. ISSN 2395-9126. 

Actividad: Ejemplo de transgénico

 USO DE LECHE DE CABRA PARA PRODUCIR ACTIVADOR TISULAR DE PLASMINÓGENO EN PCTES CON TROMBOSIS

Como ejemplo tenemos el uso de leche de cabra transgénica para producir activador tisular del plasminógeno, el cual es utilizado en pacientes con trombosis. Al ser fácil de obtener y contar con gran volumen se utiliza la glándula mamaria ya que puede llegar a expresar más de 2 g de proteína recombinante por litro de leche. Usando como promotor las proteínas que se expresan en la leche como la caseína, se introduce en el gen la proteína de interés y se obtiene la expresión de la proteína recombinante deseada en la leche. (1)

Ventajas de los transgénicos (2)

1. Se consiguen frutos de mayor tamaño y, por lo tanto, más rentables.
2. No se utilizan tantas sustancias químicas, como pesticidas ni herbicidas, para proteger los cultivos porque estos producen su propio insecticida.
3.  Pueden ser utilizados como un biorreactor para la producción de diversas vacunas, anticuerpos, biopolímeros y fármacos
4. Disminuye el costo de biofármacos y aumenta su accesibilidad.
5. Se reduce el riesgo de malas cosechas porque son más resistentes a las plagas.

Desventajas de los transgénicos (2)

1. Impide que pequeños agricultores se beneficien de las semillas modificadas por su elevado precio porque están controladas por algunas multinacionales.
2. Las nuevas especies pueden ser más invasivas que el resto e influir negativamente en el ecosistema.
3. El cruce de genes puede provocar que las bacterias se hagan resistentes a los antibióticos.
4. Tranferencia de genes puede transpasar los alérgenos y causar reacciones alérgicas en los consumidores.
5. Los hongos y virus acostumbran a mutarse como medida de protección. Esto puede dar lugar a especies desconocidas

Referencias Bibliográficas

1. Ebert KM, DiTullio P, Barry CA, Schindler JE, et al. Induction of human tissue plasminogen activator in the mammary gland of transgenic goats. Biotechnology (NY) 1994. Disponible en:  https://www.nature.com/articles/nbt0794-699
2. Ardisana, Eduardo et al. Alimentos transgénicos, la perspectiva sudamericana. Revista Chakiñan [online]. 2019, n.8 [citado  2023-01-29], pp.148-157. Disponible en: <http://scielo.senescyt.gob.ec/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2550-67222019000200148&lng=es&nrm=iso>. ISSN 2550-6722.

Actividad 12: Plásmido pOXA-48/ Producción de plásmidos recombinantes para su uso como controles de la técnica RT-PCR

 Los plásmidos son el principal vehículo de la diseminación de la resistencia a antibióticos, sobre todo en los ambientes clínicos, el plámido pOXA-48 tiene la información necesaria para codificar un mecanismo de resistencia que se conoce como carbapenemasa (resistencia a los antibióticos), este plásmido ayuda a las bacterias a sobrevivir a estos tipos de fármacos entre ellos la amoxicilina. En esta investigación se trabajó con las enterobacterias intestinales Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli porque se considera que son las más abundantes y además son las más asociadas con el pOXA-48. (1)

Tema: Producción de plásmidos recombinantes para su uso como controles de la técnica RT-PCR para el diagnóstico de los virus Chikungunya y Zika (2)

Objetivo: producir plásmidos recombinantes con secuencias nucleotídicas de fragmentos parciales de los genes E1 de CHIKV y NS5 del ZIKV, utilizando los cebadores descritos, para su uso como controles positivos en la validación específica de estas metodologías.

Gen a clonar: gen E1 de CHIKV y NS5 de Zika

Enzimas de restricción: Las bandas observadas en los geles para la primera reacción de amplificación para CHIKV y ZIKV fueron cortadas a partir del gel correspondiente a cada agente viral y purificadas empleando el estuche comercial Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up System

Enzima ligasa: enzima T4 ADN ligasa

Vector: se emplearon el plásmido comercial pGEM®-T Easy (Promega) diseñado para clonar productos de PCR y las células bacterianas Escherichiacoli XL1-Blue MRF`

Célula receptora: células Vero

Mecanismo de transferencia: conjugación bacteriana

Método de identificación de clones: técnica PCR de colonias, espectrofotometría y gel de agarosa al 2%

Referencias:

1. Hendrickx, Antoni P A et al. “blaOXA-48-like genome architecture among carbapenemase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in the Netherlands.” Microbial genomics vol. 7,5 (2021): 000512. doi: 10.1099/mgen.0.000512, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8209719/
2. Hernández, Nathaly et al. "Producción De Plásmidos Recombinantes Para Su Uso Como Controles De La Técnica RT-PCR Para El Diagnósticode Los Virus Chikungunya Y Zika". Boletín De Malariología Y Salud Ambiental, vol 60, no. 1, 2020, p. ., http://iaes.edu.ve/iaespro/ojs/index.php/bmsa/article/view/41. Accessed 23 Jan 2023.

Actividad 6: Epigenética en Diabetes Mellitus tipo II

La epigenética explica el origen del desarrollo de la salud y la enfermedad y se liga con el entorno que existe desde la concepción hasta el desarrollo postnatal. La regulación epigenética se de por metilación de ADN, modificación en histonas y por los ARN no codificantes. En este estudio se demostró que un aumento en la metilación de ADN y una disminución en la expresión de estos genes se relaciona con una secreción de insulina alterada, otro factor fue la hiperglucemia en madres diabéticas durante el desarrollo embrionario y por último los ARN no codificantes como miARN, ARNip, piARN y los IncRNA están implicados en los cambios epigenéticos. (1)

Referencia Bibliográfica: 

1.	Martagón-Rosado AJ. La epigenética en la diabetes mellitus tipo 2: una enfermedad crónica no transmisible. Alad [Internet]. 2021 [citado el 16 de enero de 2023];11(2). Disponible en: https://www.revistaalad.com/frame_esp.php?id=458

Actividad 5: Técnica FISH para el diagnóstico de cáncer de mama

 Es una técnica de citogenética molecular,  utiliza fragmentos de ADN incorporados con nucleótidos acoplados a fluoróforos (sondas) para examinar la presencia o la ausencia de secuencias complementarias, se utilizó FISH para cáncer de seno con sondas específicas para el locus HER2 en la región 17q11.2-12. Se analizaron muestras de médula ósea y sangre periférica se visualizaron 200 núcleos que no se encontraron sobrepuestos, se utilizó un microscopio de AX70 de Olympus adaptado con lámpara ultravioleta, las imágenes se capturaron y digitalizaron con el programa FISHview de Applied Spectral Imaging. 

Locus HER2 en la región 17q11.2-12 (señal roja) y la región centromérica CEP17 (señal verde)

Referencias Bibliográficas

1. Roncancio T, Parra R, Mejía J, Guevara G. Hibridación in situ fluorescente (FISH) en el Instituto Nacional de Cancerología (INC) de Colombia. Experiencia de 5 años. rev.colomb.cancerol. [Internet]. marzo de 2019 [citado el 8 de enero de 2023]; 23(1): 3-11. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-90152019000100003&lng=en.  https://doi.org/10.35509/01239015.73 .