Actividad 12: Plásmido pOXA-48/ Producción de plásmidos recombinantes para su uso como controles de la técnica RT-PCR

 Los plásmidos son el principal vehículo de la diseminación de la resistencia a antibióticos, sobre todo en los ambientes clínicos, el plámido pOXA-48 tiene la información necesaria para codificar un mecanismo de resistencia que se conoce como carbapenemasa (resistencia a los antibióticos), este plásmido ayuda a las bacterias a sobrevivir a estos tipos de fármacos entre ellos la amoxicilina. En esta investigación se trabajó con las enterobacterias intestinales Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli porque se considera que son las más abundantes y además son las más asociadas con el pOXA-48. (1)

Tema: Producción de plásmidos recombinantes para su uso como controles de la técnica RT-PCR para el diagnóstico de los virus Chikungunya y Zika (2)

Objetivo: producir plásmidos recombinantes con secuencias nucleotídicas de fragmentos parciales de los genes E1 de CHIKV y NS5 del ZIKV, utilizando los cebadores descritos, para su uso como controles positivos en la validación específica de estas metodologías.

Gen a clonar: gen E1 de CHIKV y NS5 de Zika

Enzimas de restricción: Las bandas observadas en los geles para la primera reacción de amplificación para CHIKV y ZIKV fueron cortadas a partir del gel correspondiente a cada agente viral y purificadas empleando el estuche comercial Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up System

Enzima ligasa: enzima T4 ADN ligasa

Vector: se emplearon el plásmido comercial pGEM®-T Easy (Promega) diseñado para clonar productos de PCR y las células bacterianas Escherichiacoli XL1-Blue MRF`

Célula receptora: células Vero

Mecanismo de transferencia: conjugación bacteriana

Método de identificación de clones: técnica PCR de colonias, espectrofotometría y gel de agarosa al 2%

Referencias:

1. Hendrickx, Antoni P A et al. “blaOXA-48-like genome architecture among carbapenemase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in the Netherlands.” Microbial genomics vol. 7,5 (2021): 000512. doi: 10.1099/mgen.0.000512, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8209719/
2. Hernández, Nathaly et al. "Producción De Plásmidos Recombinantes Para Su Uso Como Controles De La Técnica RT-PCR Para El Diagnósticode Los Virus Chikungunya Y Zika". Boletín De Malariología Y Salud Ambiental, vol 60, no. 1, 2020, p. ., http://iaes.edu.ve/iaespro/ojs/index.php/bmsa/article/view/41. Accessed 23 Jan 2023.