Actividad 4: Análisis de los pasos de la técnica PCR

 Tema: Evaluación de la prueba COVID-19 RT-qPCR en grupos de muestras múltiples

 Objetivo:probars la capacidad de la prueba estándar RT-qPCR para detectar una sola muestra positiva dentro de un conjunto de muestras negativas.

Muestra: hisopado nasofaríngeo y nasal

Tipo de ácido nucleico: ARN viral

Extracción: . Se mezcló un volumen de 500 μL del tubo agrupado con 2 mL de tampón de lisis para la inactivación, y se extrajo el ARN usando NUCLISENS easyMAG (biomerieux) y se eluyó en 50 μl de tampón de elución.

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ge el material genético del virus a partir de

un frotis de nariz o garganta del paciente

a diagnosticar. Esta muestra pasa por un

proceso de purificación porque a la más

mínima contaminación de ADN puede al

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terar los resultados.

Genes a analizar: Se amplificaron los genes de la nucleocápside (N), de la envoltura (E) y de la ARN polimerasa (RdRp).

Tipo de PCR: a reacción en cadena de polimerasa con retrotranscripción (RT-qPCR)

Pasos: Las reacciones se calentaron a 50 °C durante 20 minutos para la transcripción inversa, se desnaturalizaron a 95 °C durante 15 minutos, y luego se realizaron 45 ciclos de amplificación a 94°C por 15 segundos y 58°C por 30 segundos. 

Visualización: La fluorescencia se midió utilizando 4 canales de fluorescencia: FAM (gen E), HEX (control interno), Cal Red 610 (gen RdRp) y Quasar 670 (gen N).

Referencias bibliográficas:

Yelin I, Noga, et al. Evaluation of COVID-19 RT-qPCR Test in Multi sample pools, Clinical Infectious Diseases , volumen 71, número 16, 15 de octubre de 2020, páginas 2073–2078, https://doi.org/10.1093/cid/ciaa531